一种利用微生物发酵生产1，3‑丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用微生物发酵生产1，3‑丙 二醇的方法。

背景技术

1，3‑丙二醇是一种重要的化工原料和医药中间体，在聚酯纤维生产以及聚 氨基甲酸乙酯和环状化合物的制造中具有广泛的应用。由1，3‑丙二醇合成的聚 酯具有可生物降解等独特的性质和优异的性能。近年来，1，3‑丙二醇作为重要 的有机合成原料和中间体，因其独特性能以及广泛的用途成为研究开发的热点。

1，3‑丙二醇的生产方法主要有三种：丙烯醛水合氢化法、环氧乙烷碳基化 法和微生物转化法。微生物转化法虽然起步较早，但是直到二十世纪八十年代 才逐渐引起人们的重视。尽管目前的主要方法仍然是化学法，但是与化学法相 比，微生物转化法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省能源、设备投资 少和环境良好等特点，是一种生产成本最低、污染最少的方法，符合当今“绿 色化工”和“可持续性发展”的要求。

通过微生物发酵生产1，3‑丙二醇的生产工艺相对成熟，主要分为两类：以 葡萄糖为原料利用基因工程菌转化生产1，3‑丙二醇及以甘油为原料利用克雷伯 杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)、成团肠 杆菌(Enterobacter agglomerans)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum) 和巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridium pasteuianu)等细菌转化生产1，3‑丙二醇。由 于微生物转化的生产模式是利用微生物自身代谢过程进行有用产品的生产，因 此在实际过程中发酵副产物种类较多，尤其是存在于主代谢干路上的产物如乳 酸、乙酸、乙醇等，这些副产物的出现不但会对发酵体系产生影响，以致影响 发酵生产效率，而且会对后期产品分离造成影响。因此，减少发酵体系中副产 物的生成，有助于提高1，3‑丙二醇的产率。

CN200510011867.8公开了一种利用生产生物柴油副产物甘油生产1，3‑丙二 醇的方法，该方法将生物柴油生产过程中分离出的副产物粗甘油作为发酵法生 产1，3‑丙二醇的底物，以克雷伯氏杆菌或丁酸梭菌、巴斯德梭菌通过厌氧或有 氧发酵进行1，3‑丙二醇发酵生产。但是该方法中1，3‑丙二醇的产率及生产强度 并不高并且副产物多。CN03119280.7公开了一种采用两段双底物集成发酵生产 1，3‑丙二醇的方法，该方法中二级种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物， 将耗氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个发酵 罐中进行。虽然这种方法能够减少工艺步骤，提高设备的利用率，缩短了工艺 周期，但是由于该过程中存在菌体生长和甘油转化两个阶段，易产生大量的副 产物，影响最终1，3‑丙二醇的产率。CN200510011917.2公开了一种利用外源添 加反丁烯二酸促进微生物合成1，3‑丙二醇的方法，该方法在发酵培养基中添加 反丁烯二酸作为一种外源电子受体，从而加速菌体对甘油的利用。通过其实施 例可以看出，这种方法虽然可以提高菌体对甘油的利用率，提高1，3‑丙二醇浓 度和生产强度，但是副产物也明显增多。CN200510047540.6公开了一种微生物 利用甘油厌氧发酵生产1，3‑丙二醇的方法，该方法通过在发酵培养基中或在菌 体生长的指数期添加适量的多元酸，该多元酸可以强化代谢过程中生成丙酮酸 后的代谢过程，但是该方法并不能有效降低副产物的生成，因为加入的多元酸 并不能对丙酮酸的生成进行调控，而丙酮酸是生成多种副产物的来源，代谢中 的丙酮酸会完全分解。CN03121946.2公开了一种通过外源添加还原剂促进菌体 合成1，3‑丙二醇的方法，该方法利用1，3‑丙二醇生物合成过程中需要消耗一定 量还原当量的特征，在发酵培养基或在厌氧发酵过程中添加适量的还原剂，增 强菌体中还原当量的积累，促进底物甘油沿还原途径代谢，提高1，3‑丙二醇的 合成浓度和转化率。虽然在培养基中添加还原剂，理论上有助于甘油向1，3‑丙 二醇转化，但是在整个代谢途径中，大量还原当量的介入会促进很多副反应， 如丙酮酸向乳酸的转化、磷酸烯醇式丙酮酸向琥珀酸的转化、乙酰C_OA向乙醇的 转化等，因此还原剂的加入会导致大量副产物的生成。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种利用微生物发酵生产1，3‑丙二醇的 方法，该方法通过在发酵培养基中加入具有特殊构型的添加物，该添加物能够 抑制甘油代谢过程中丙酮酸激酶的活性，减少代谢路径中丙酮酸中间体的生成， 进而降低了由丙酮酸代谢生成的乙醇等副产物的含量，提高甘油底物的转化率 效率、增强1，3‑丙二醇生产强度。

本发明利用微生物发酵生产1，3‑丙二醇的方法，包括种子培养过程和发酵 培养过程，发酵培养过程所用的发酵培养基中含有浓度为0.3g/L～0.8g/L的含α‑ 羰基或α‑氨基的三碳或四碳羧酸类有机物，丙酮酸除外。

本发明方法中，所述的丙酮酸除外的含α‑羰基或α‑氨基的三碳或四碳羧酸 类有机物包括丙氨酸、α‑氨基丁酸、2‑丁酮酸。

本发明方法发酵培养过程以甘油为底物，种子液体积和发酵培养基体积比 为1∶10～1∶30，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为200rpm～500rpm，pH控 制在6～8之间，氮气通入量为2vvm～4vvm，发酵过程中保持厌氧条件。

本发明方法发酵培养过程所用的甘油底物来源于化学法、生物法及超临界 法生产生物柴油过程中所生成的副产物甘油，该副产物甘油只需进行简单的分 离处理即可作为发酵培养中的甘油底物。

本发明方法中发酵方式可以是间歇发酵、批式流加发酵或连续发酵。间歇 发酵时培养基中甘油浓度为25g/L～45g/L，发酵时间为12h～60h。

本发明方法种子培养过程中菌种保藏液与种子培养基体积比为1∶100～1∶ 500，培养温度为30℃～40℃，搅拌速度为100rpm～200rpm，pH为6～8，培养 时间为10h～20h，培养期间保持厌氧条件。

本发明方法中，所述的菌种为克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏 柠檬杆菌(Citrobacter freundii)等厌氧或兼性厌氧菌。

与现有技术相比，本发明发酵生产1，3‑丙二醇的方法具有如下优点：

1、本发明方法通过在发酵培养基中加入适量的含α‑羰基或含α‑氨基的三 碳及四碳羧酸类有机物(丙酮酸除外，以下相同)，含α‑羰基或含α‑氨基的三 碳及四碳羧酸类有机物由于其独特的分子构型(含α‑羰基或α‑氨基和适宜的分 子链长度)能够抑制甘油代谢过程中丙酮酸激酶的活性，减少代谢路径中丙酮 酸中间体的生成，进而降低了由丙酮酸代谢生成的乙醇、乙酸等副产物的含量， 提高甘油底物的转化率效率、增强1，3‑丙二醇生产强度。在采用间歇式发酵方 式，进行1L水平的发酵试验过程中，相同发酵条件下，甘油底物发酵生成1，3‑ 丙二醇的摩尔转化率可以达到73.3％，明显优于比较例中的63.8％。

2、从现有技术可知，在甘油的代谢通路中，甘油可以在厌氧条件下通过氧 化和还原两条平行路径进行代谢。在氧化途径中，甘油被甘油脱氢酶脱氢生成 二羟基丙酮，然后进一步代谢成为丙酮酸；在还原途径中，甘油则被甘油脱水 酶催化脱水生成3‑羟基丙醛，进一步在NADH₂的参与下，由1，3‑丙二醇氧化 还原酶催化生成1，3‑丙二醇。甘油氧化途径产生的丙酮酸在NADH₂作用下， 通过不同的还原反应，可以生成乙酸、乙醇、乳酸等副产物。由于各种副产物 的产生起始于一个共同的初始物——丙酮酸，因此通过抑制由甘油转化为丙酮 酸的反应，不但可以减少副产物生成过程中NADH₂的消耗，以增加甘油还原途 径中NADH₂的供给，增强1，3‑丙二醇的生产强度，而且可以减少副产物的生 成，提高甘油生成1，3‑丙二醇的摩尔转化率。

3、由甘油转化为丙酮酸的反应有多种酶参与，如甘油脱氢酶、二羟基丙酮 激酶、丙酮酸激酶等，通过加入酶的竞争性抑制剂或底物类似物可以有效的抑 制酶活，减少副反应物的生成。由于丙酮酸激酶存在变构抑制效应，因此可以 在培养基中添加适当的含α‑羰基的四碳羧酸类有机物或含α‑氨基的三碳及四 碳羧酸类有机物，从而在底物水平抑制该酶的活性，以起到减少副产物生成的 作用。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的效果，但不构成对本发明的限制。以 下实施例和比较例中均采用间歇发酵方式，发酵过程中所用的甘油底物为生产 生物柴油过程中产生的粗甘油。

本发明方法中，以Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液 相分析系统，其中分离柱选用Aminex HPX‑87H有机酸和醇分析柱，用于酸类 和醇类的分离。以乳酸、甘油、乙酸、1，3‑丙二醇、乙醇等标准样品建立标准 图谱，反应过程中定时测量反应体系中甘油的消耗情况、产物1，3‑丙二醇以及 主要副产物乙醇的积累情况。

本发明方法中，所用的菌种为克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)，来自 中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，菌种在中国普通微生物菌种保藏中心 (CGMCC)保藏，菌种保藏号：0798。

本发明方法中种子培养基及发酵培养基的基本组成如下：

实施例1利用含有0.5g/L丙氨酸的发酵培养基进行1，3‑丙二醇发酵试验

(1)种子培养：取液体保藏的克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)菌种保 藏液1mL加入200mL种子培养基中，混合于摇瓶内，进行种子液培养。培养 条件：培养温度为37℃，摇床震荡速度设为100rpm，pH控制在7.0，培养过 程中保持厌氧条件，共培养15h。

(2)发酵过程：发酵罐体积选择1L，应用间歇发酵、一次投加甘油模式。 取40mL种子液加入460mL含有0.5g/L丙氨酸的发酵培养基中。该发酵培养基 的配置方法是在基本培养基的基础上，添加丙氨酸及底物甘油，使其含有0.5g/L 丙氨酸、40g/L甘油。发酵控制条件：温度为37℃，搅拌速度为400rpm，过程 中以5MNaOH调节pH，使其控制为7，发酵过程中通入氮气以保持厌氧环境， 氮气通入量为2vvm，全发酵过程时间为16h。

(3)通过液相分析系统，测量反应体系中甘油的消耗情况、产物1，3‑丙 二醇以及副产物乙醇等的积累情况。通过液相分析，在产物中1，3‑丙二醇的浓 度为22.047g/L，乙醇浓度为1.190g/L，甘油残留浓度为3.575g/L。通过计算， 1，3‑丙二醇的摩尔得率为73.3％，副产物乙醇的摩尔得率为6.53％。

实施例2利用含有0.3g/L α‑氨基丁酸的发酵培养基进行1，3‑丙二醇发酵试验

(1)种子培养：取液体保藏的克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)菌种保 藏液1mL加入300mL种子培养基中，混合于摇瓶内，进行种子液培养。培养 条件：培养温度为37℃，摇床震荡速度设为100rpm，pH控制在7.0，培养过 程中保持厌氧条件，共培养16h。

(2)发酵过程：发酵罐体积选择1L，应用间歇发酵、一次投加甘油模式。 取20mL种子液加入480mL含有0.3g/L α‑氨基丁酸的发酵培养基中。该发酵培 养基的配置方法是在基本培养基的基础上，添加α‑氨基丁酸及底物甘油，使其 含有0.3g/L α‑氨基丁酸、40g/L甘油。发酵控制条件：温度为37℃，搅拌速度 为400rpm，过程中以5MNaOH调节pH，使其控制为7，发酵过程中通入氮气 以保持厌氧环境，氮气通入量为2vvm，全发酵过程时间为16h。

(3)通过液相分析系统，测量反应体系中甘油的消耗情况、产物1，3‑丙 二醇以及副产物乙醇等的积累情况。通过液相分析，在产物中1，3‑丙二醇的浓 度为21.878g/L，乙醇浓度为1.293g/L，甘油残留浓度为4.122g/L。通过计算，1， 3‑丙二醇的摩尔得率为73.8％，副产物乙醇的摩尔得率为7.20％。

实施例3利用含有0.8g/L2‑丁酮酸的发酵培养基进行1，3‑丙二醇发酵试验

(1)种子培养：取液体保藏的克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)菌种保 藏液1mL加入200mL种子培养基中，混合于摇瓶内，进行种子液培养。培养 条件：培养温度为36℃，摇床震荡速度设为200rpm，pH控制在7.0，培养过 程中保持厌氧条件，共培养16h。

(2)发酵过程：发酵罐体积选择1L，应用间歇发酵、一次投加甘油模式。 取30mL种子液加入470mL含有0.8g/L丙氨酸的发酵培养基中。该发酵培养基 的配置方法是在基本培养基的基础上，添加2‑丁酮酸及底物甘油，使其含有 0.8g/L2‑丁酮酸、40g/L甘油。发酵控制条件：温度为37℃，搅拌速度为400rpm， 过程中以5MNaOH调节pH，使其控制为7，发酵过程中通入氮气以保持厌氧 环境，氮气通入量为2vvm，全发酵过程时间为16h。

(3)通过液相分析系统，测量反应体系中甘油的消耗情况、产物1，3‑丙 二醇以及主要副产物乙醇的积累情况。通过液相分析，在产物中1，3‑丙二醇的 浓度为20.209g/L，乙醇浓度为0.755g/L，甘油残留浓度为5.809g/L。通过计算， 甘油生产1，3‑丙二醇的摩尔得率为71.5％，副产物乙醇的摩尔得率为5.73％。

比较例

按照CN200510047540.6的方案，发酵用的基本培养基中含有浓度为0.5g/L 的琥珀酸，其余条件同实施例1。通过液相分析，在产物中1，3‑丙二醇的浓度 为18.922g/L，乙醇浓度为1.418g/L，甘油残留浓度为4.141g/L。通过计算，1， 3‑丙二醇的摩尔得率为63.8％，副产物乙醇的摩尔得率为7.90％。

由比较例和实施例1可知，发酵培养基中加入相同质量的丁二酸和丙氨酸， 丙氨酸的加入能够明显提高1，3‑丙二醇摩尔得率，降低主要副产物乙醇的摩尔 得率，1，3‑丙二醇摩尔得率提高了14.9％，主要副产物乙醇的摩尔得率降低了 17.1％。