【中国发明,中国发明授权】一种高效稳定的TMB显色液及其制备方法

有权-审定授权 中国

授权公告日/公开日:
2015.06.10
专利有效期:
2013.12.13-2033.12.13
技术分类:
G01:测量;测试
转化方式:
转让
价值度指数:
65.0分
价格:
¥8000.00
5422 0

发布人

山东博科生物产业有限公司

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著录项

申请号
CN201310682191.X
申请日
20131213
公开/公告号
CN103698505A
公开/公告日
20140402
申请/专利权人
[山东博科生物产业有限公司]
发明/设计人
[谭柏清, 李志明, 甘宜梧]
主分类号
G01N33/531
IPC分类号
C12N 9/0008(2013.01) C12N 9/16
CPC分类号
C12N 9/0008(2013.01) C12N 9/16(2013.01)
分案申请地址
国省代码
山东(37)
颁证日
G06T1/00
代理人
[李桂存]

摘要

市场上TMB显色液存在稳定性差,保存时间短,显色背景高,灵敏度低等的缺点,本发明提供了一种高效稳定的TMB显色液。其特征在于,各组分的摩尔浓度或质量分数为:TMB的摩尔浓度为1.2mmol/L,H2O2的摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405的质量分数为0.3%,过氧化脲的质量分数为0.5%,醋酸钠的摩尔浓度为0.2mol/L,L(+)-酒石酸的摩尔浓度为0.027mol/L。本发明为TMB单相显色液,使用前无需混合,可以减少人为操作过程中的误差,通过引入非离子表面活性剂,使单相TMB显色液可以长期稳定保存。

法律状态

法律状态公告日 20240123
法律状态 专利权质押登记、变更及注销
法律状态信息 专利权质押登记注销
IPC(主分类):G01N 33/531
授权公告日:20150610
申请日:20131213
专利号:ZL201310682191X
登记号:Y2023980042636
出质人:山东博科生物产业有限公司
质权人:济南农村商业银行股份有限公司天桥支行
注销日:20240105
法律状态公告日 20230620
法律状态 专利权质押合同登记的生效、变更及注销
法律状态信息 专利权质押合同登记的生效
IPC(主分类):G01N 33/531
专利号:ZL201310682191X
登记号:Y2023980042636
登记生效日:20230601
出质人:山东博科生物产业有限公司
质权人:济南农村商业银行股份有限公司天桥支行
发明名称:一种高效稳定的TMB显色液及其制备方法
申请日:20131213
授权公告日:20150610
法律状态公告日 20230616
法律状态 专利权质押合同登记的生效、变更及注销
法律状态信息 专利权质押合同登记的注销
IPC(主分类):G01N 33/531
授权公告日:20150610
申请日:20131213
专利号:ZL201310682191X
登记号:Y2023980032056
出质人:山东博科生物产业有限公司
质权人:济南农村商业银行股份有限公司天桥支行
解除日:20230531
法律状态公告日 20230224
法律状态 专利权质押合同登记的生效、变更及注销
法律状态信息 专利权质押合同登记的生效
IPC(主分类):G01N 33/531
专利号:ZL201310682191X
登记号:Y2023980032056
登记生效日:20230206
出质人:山东博科生物产业有限公司
质权人:济南农村商业银行股份有限公司天桥支行
发明名称:一种高效稳定的TMB显色液及其制备方法
申请日:20131213
授权公告日:20150610
法律状态公告日 20220712
法律状态 专利权质押合同登记的生效、变更及注销
法律状态信息 专利权质押合同登记的注销
IPC(主分类):G01N 33/531
授权公告日:20150610
申请日:20131213
专利号:ZL201310682191X
登记号:Y2021370000122
出质人:山东博科生物产业有限公司
质权人:济南农村商业银行股份有限公司天桥支行
解除日:20220624
法律状态公告日 20211119
法律状态 专利权质押合同登记的生效、变更及注销
法律状态信息 专利权质押合同登记的生效
IPC(主分类):G01N 33/531
专利号:ZL201310682191X
登记号:Y2021370000122
登记生效日:20211101
出质人:山东博科生物产业有限公司
质权人:济南农村商业银行股份有限公司天桥支行
发明名称:一种高效稳定的TMB显色液及其制备方法
申请日:20131213
授权公告日:20150610
法律状态公告日 20150610
法律状态 授权
法律状态信息 授权
法律状态公告日 20150520
法律状态 著录事项变更
法律状态信息 著录事项变更
IPC(主分类):G01N 33/531
变更事项:发明人
变更前:谭柏清 李志明 甘宜梧
变更后:马万山 李志明 甘宜梧 谭柏清 李静 王绮
法律状态公告日 20140430
法律状态 实质审查的生效
法律状态信息 实质审查的生效
IPC(主分类):G01N 33/531
申请日:20131213
法律状态公告日 20140402
法律状态 公开
法律状态信息 公开
暂无数据

权利要求

权利要求数量(2

独立权利要求数量(1

1.一种高效稳定的TMB显色液,其特征在于,各组分的摩尔浓度或质量分数为:TMB的摩尔浓度为1.2mmol/L,H 2O 2的摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405的质量分数为0.3%,过氧化脲的质量分数为0.5%,醋酸钠的摩尔浓度为0.2mol/L,L(+)-酒石酸的摩尔浓度为0.027 mol/L。

2.根据权利要求1中的一种高效稳定的TMB显色液的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

a.制备A液:以10mL二甲亚砜为溶剂,缓慢加入TMB,搅拌均匀使其充分溶解,TMB最终摩尔浓度为0.12mol/L;

b.制备B液:取1L蒸馏水,加入醋酸钠16.406g充分溶解,使之终摩尔浓度为0.2mol/L;然后加入L(+)-酒石酸4.1g充分溶解,使之终摩尔浓度为0.027 mol/L, 溶液最终pH值约为5.0;

c.在B液中加入适量A液、曲拉通X-405、H 2O 2和过氧化脲,使TMB终摩尔浓度为1.2 mmol/L,H 2O 2终摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405的终质量分数为0.3%,过氧化脲的终质量分数为0.5%。

1.一种高效稳定的TMB显色液,其特征在于,各组分的摩尔浓度或质量分数为:TMB的摩尔浓度为1.2mmol/L,H2O2的摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405的质量分数为0.3%,过氧化脲的质量分数为0.5%,醋酸钠的摩尔浓度为0.2mol/L,L(+)-酒石酸的摩尔浓度为0.027 mol/L。

2.根据权利要求1中的一种高效稳定的TMB显色液的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

a.制备A液:以10mL二甲亚砜为溶剂,缓慢加入TMB,搅拌均匀使其充分溶解,TMB最终摩尔浓度为0.12mol/L;

b.制备B液:取1L蒸馏水,加入醋酸钠16.406g充分溶解,使之终摩尔浓度为0.2mol/L;然后加入L(+)-酒石酸4.1g充分溶解,使之终摩尔浓度为0.027 mol/L, 溶液最终pH值约为5.0;

c.在B液中加入适量A液、曲拉通X-405、H2O2和过氧化脲,使TMB终摩尔浓度为1.2 mmol/L,H2O2终摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405的终质量分数为0.3%,过氧化脲的终质量分数为0.5%。

说明书

技术领域

本发明涉及临床体外检测技术,特别涉及一种高效稳定的TMB显色液及其制备方法。

背景技术

自从Engvall和Perlman(1971)首次报道建立酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)以来,由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,使其得到迅速的发展和广泛应用。目前酶免疫分析(EIA)技术,已被广泛应用于抗原,半抗原或抗体的定量或定性检测分析。酶联免疫吸附 (ELISA) 检测方法虽然有很多种,但各种方法都离不开酶结合物和显色剂。在 ELISA 试剂中应用最广泛的酶是辣根过氧化物酶 (HRP),而该系统的显色剂有多种,目前市场最常用的是TMB (3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺)。辣根过氧化物酶(HRP)及其藕联物是酶联免疫分析技术中常用的一种酶,由于3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在HRP的显色反应体系中,比其它色原具有更高的灵敏度且无至癌性而被广泛应用。

TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)是一种新型HRP(辣根过氧化物酶)色原底物。相对其他显色底物,TMB 以显色高效、无毒、不致癌、稳定性好等特点成为 ELISA 检测的主流显色剂。在ELISA检测时,HRP催化过氧化物释放出氧使 TMB 被氧化成蓝色的产物,加入酸性的终止液终止反应后,蓝色溶液变成橙黄色,在 450nm 波长有最大吸收峰。通过测量吸光度,便可定性或定量判断出被检测物的含量。

常见的 TMB 显色试剂多由几个组分共同组成,并且常需要现配现用,使用不便,且容易导致检测结果不太稳定。一般市场常见 TMB 显色试剂通常分为 A、B 两种贮存液,使用需将两者按比例混合,操作繁琐且容易错配,常导致实验失败。此外,市场上也有少见的单相的TMB 显色液,但常常存在稳定性差,保存时间短,显色背景高,灵敏度低等的缺点。

发明内容

针对上述技术背景,本发明提供了一种高效稳定的TMB显色液及其制备方法。

本发明的一种高效稳定的TMB显色液,其特征在于,各组分的摩尔浓度或质量分数为:TMB的摩尔浓度为1.2mmol/L,H2O2的摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405的质量分数为0.3%,过氧化脲的质量分数为0.5%,醋酸钠的摩尔浓度为0.2mol/L,L(+)-酒石酸的摩尔浓度为0.027 mol/L。

所述的一种高效稳定的TMB显色液的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

a.制备A液:以10mL二甲亚砜为溶剂,缓慢加入TMB,搅拌均匀使其充分溶解。

b.制备B液:取1L蒸馏水,加入醋酸钠16.406g使之终摩尔浓度为0.2mol/L;然后加入L(+)-酒石酸4.1g使之终摩尔浓度为0.027 mol/L,溶液最终pH值约为5.0。

c.在B液中加入适量A液、曲拉通X-405(Triton X-405)、H2O2和过氧化脲,使TMB终摩尔浓度为1.2 mmol/L,H2O2终摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405(Triton X-405)的终质量分数为0.3%,过氧化脲的终质量分数为0.5%。

本发明的使用方法:

用适当的干净容器(用纯净水反复冲洗),倒出适量的单组分TMB显色液,待达到室温后即可进行如下步骤:

a)    加液:加完HRP结合物并温育一定时间后,洗板3-5次,每孔加TMB显色液100uL。 根据实验需要,在室温(15-25°C)或37°C下温育10-30分钟。 

b)    终止:加等体积的1mol/L盐酸或硫酸溶液可终止反应,孔中反应液由蓝色变为黄色。

c)    读数:终止反应后30分钟内在450nm处读数。

相比市场常见TMB显色液而言,本发明为TMB单相显色液,使用前无需混合,简化操作流程,方便快捷,可以减少人为操作过程中的误差。通过引入非离子表面活性剂,促进TMB的溶解和稳定,使单相TMB显色液可以长期稳定保存,在2~8℃条件下保存有效期可达3年,并且显色终止后读数稳定。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1 实施例1方法制备的TMB显色液用酸溶液终止反应后TMB黄色产物的稳定性。

图2 实施例1方法制备的TMB显色液存放时间段后的稳定性。

具体实施方式

实施例1

本发明所述的一种高效稳定的TMB 显色液的制备方法包括如下步骤:

a.制备A液:以10mL二甲亚砜为溶剂,缓慢加入TMB,搅拌均匀使其充分溶解。

b.制备B液:取1L蒸馏水,加入醋酸钠16.406g充分溶解,使之终摩尔浓度为0.2mol/L;然后加入L(+)-酒石酸(L(+)-2,3-二羟基丁二酸)4.1g充分溶解,使之终摩尔浓度为0.027 mol/L, 溶液最终pH值约为5.0。

c.在B液中加入适量A液、曲拉通X-405(Triton X-405)、H2O2和过氧化脲,使TMB终摩尔浓度为1.2 mmol/L,H2O2终摩尔浓度为3.1mmol/L,曲拉通X-405(Triton X-405)的终质量分数为0.3%,过氧化脲的终质量分数为0.5%,醋酸钠的摩尔浓度为0.2mol/L,L(+)-酒石酸的摩尔浓度为0.027 mol/L。

实施例2

将实施例1的TMB显色液与国家食品药品监督管理局认可的某公司商品化的TMB显色液(简称为:对比显色液1)进行对比。

该对比显色液配方,其中各组分的摩尔浓度或质量分数为:

TMB的摩尔浓度为2.0mmol/L,

H2O2的摩尔浓度为4.0mmol/L,

过氧化脲的质量分数为0.1%,

磷酸氢二钠的摩尔浓度为0.1mol/L,

柠檬酸的摩尔浓度为0.013 mol/L。

以丙型肝炎病毒核心抗原试剂盒(双抗体夹心法ELISA)为例,显色15min后终止反应,在终止反应后的0,15,30,45,60min时测得OD值(λ=450nm)。用酸溶液终止反应后,计算TMB黄色产物的稳定性。

对比结果见说明书附图图1。由图1可以看出,实施例1方法得到的TMB显色液在终止反应后,TMB黄色产物的稳定性明显优于对比组TMB显色液。实施例1方法得到的TMB显色液在终止反应30分钟后,TMB换色产物几乎没有衰减;在终止反应60min时,仅有轻微衰减,稳定性明显提高。

实施例3

将用实施例1的方法制备的TMB显色液与国家食品药品监督管理局认可的某公司商品化的TMB显色液进行比较(简称为:对比显色液1)。

以丙型肝炎病毒核心抗原试剂盒(双抗体夹心法ELISA)为例,分别用实施例1的方法制备的TMB显色液和国家食品药品监督管理局认可的某公司商品化的TMB显色液(简称为:对比显色液1)做显色剂,测试丙肝核心抗原(HCV-cAg)标准品(浓度:80pg/mL),测试完成后试剂盒等均放置在2-8℃保存,每隔2个月测试一次,记录OD值。

对比结果见说明书附图图2。由图2可知,实施例1的方法制备的TMB显色液可以长期稳定存放,至少可以放置3年。

由此可见,相比市场常见TMB显色液而言,本发明为TMB单相显色液,使用时无需混合,简化操作流程,方便快捷,极大的减少人为操作误差。此外,通过加入非离子表面活性剂曲拉通X-405(Triton X-405),促进TMB的溶解和稳定,使单相TMB显色液可以长期稳定保存,在2~8℃条件下有效期3年,并且显色终止后读数稳定。可证明,本发明所涉及的TMB显色液具有高效稳定的特点,使用方便,可以满足酶联免疫试剂盒对显色底物液的各项要求。

价值度评估

技术价值

经济价值

法律价值

0 0 0

65.0

0 50 75 100
0~50 50~75 75~100 价值较低 中等价值 价值较高

专利价值度是通过科学的评估模

型对专利价值进行量化的结果,

基于专利大数据针对专利总体特

征指标利用计算机自动化技术对

待评估专利进行高效、智能化的

分析,从技术、经济和法律价值

三个层面构建专利价值评估体

系,可以有效提升专利价值评估

的质量和效率。

总评:65.0


该专利价值中等 (仅供参考)

        该专利的技术、经济、法律价值经系统自动评估后的总评得分处于平均水平,可以重点研究利用其技术价值,根据法律价值的评估结果选择合适的使用借鉴方式。
        本专利文献中包含【1 个技术分类】,从一定程度上而言上述指标的数值越大可以反映出所述专利的技术保护及应用范围越广。 【被引用次数2 次】专利被引次数越多越能能够体现出该专利在相关技术领域研发中所发挥的基础性作用,代表着专利公开的内容有更多的产业利用价值。 【专利权的维持时间11 年】专利权的维持时间越长,其价值对于权利人而言越高。 尤其重要是,该专利 【权利质押5 次】、 都从侧面反应出该专利的技术、经济和法律价值。

技术价值    33.0

该指标主要从专利申请的著录信息、法律事件等内容中挖掘其技术价值,专利类型、独立权利要求数量、无效请求次数等内容均可反映出专利的技术性价值。 技术创新是专利申请的核心,若您需要进行技术借鉴或寻找可合作的项目,推荐您重点关注该指标。

部分指标包括:

授权周期(发明)

17 个月

独立权利要求数量

0 个

从属权利要求数量

0 个

说明书页数

3 页

实施例个数

0 个

发明人数量

6 个

被引用次数

2 次

引用文献数量

2 个

优先权个数

0 个

技术分类数量

1 个

无效请求次数

0 个

分案子案个数

0 个

同族专利数

0 个

专利获奖情况

保密专利的解密

经济价值    10.0

该指标主要指示了专利技术在商品化、产业化及市场化过程中可能带来的预期利益。 专利技术只有转化成生产力才能体现其经济价值,专利技术的许可、转让、质押次数等指标均是其经济价值的表征。 因此,若您希望找到行业内的运用广泛的热点专利技术及侵权诉讼中的涉案专利,推荐您重点关注该指标。

部分指标包括:

申请人数量

1

申请人类型

企业

许可备案

0 次

权利质押

5 次

权利转移

0 个

海关备案

法律价值    22.0

该指标主要从专利权的稳定性角度评议其价值。专利权是一种垄断权,但其在法律保护的期间和范围内才有效。 专利权的存续时间、当前的法律状态可反映出其法律价值。故而,若您准备找寻权属稳定且专利权人非常重视的专利技术,推荐您关注该指标。

部分指标包括:

存活期/维持时间

11

法律状态

有权-审定授权