本发明涉及一种辣根过氧化物酶保护剂，属于临床体外检测技术领域。

酶联免疫测定法(ELISA)是基于抗原抗体结合的高度特异性及酶的高效催化性的一种免疫分析法,由于动物机体天然存在产生各种抗体的能力,因此,根据抗原抗体特异性结合原理设的这种免疫分析方法,几乎可以应用于所有的可溶性抗原的检测。并且,随着单克隆抗体技术的发展应用,ELISA已广泛应用于临床医学、动物检疫、食品科学、植物病毒、药物残留、病虫害防治等领域,它的最小可测值可达到ng甚至pg水平。与放射性免疫测定(RIA)相比,酶免疫测定中待测物的含量是通过酶标记物的酶催化显色反应来判断的,其优点是标记试剂比较稳定,且无放射性的危害,能够客观的显示结果, 因此其应用范围更广。

ELISA 常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)和β-D-半乳糖苷酶(Gal)等。其中HRP易于提取,价格相对低廉,与抗原或抗体偶联后,活性很少受损失。因此,是迄今为止在ELISA中应用最为广泛的标记用酶。

酶联免疫测定法(ELISA)试剂盒的推广普及与其本身的高质量密不可分，而稳定性则是试剂盒的质量的重要指标之一。有较好的稳定性可以保证试剂盒在有效期内的测定结果的准确性和可靠性，并且便于推广应用。酶联免疫测定法(ELISA)试剂盒的稳定性受多方面因素影响，其中标记酶的活性是重要因素之一。而辣根过氧化物酶(HRP)化学本质为蛋白质，很多物理因素或化学因素均会引起其变性失活，所有这些都可以使蛋白质生物活性降低甚至丧失其功能，特别是在蛋白浓度比较低的情况下。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种辣根过氧化物酶保护剂，其能增加辣根过氧化物酶的稳定性。

本发明提供的HRP（辣根过氧化物酶）保护剂包含的组分及其含量如下：

HEPES缓冲液(pH=7.4)             50mM

BSA                                     1~2g/L

MgSO4                                 8~10mM

NaCl                                    0.5~2mM

ZnSO4                                 0.2~1mM

β-环糊精                             0.1~0.5g/L

海藻糖                                  0.5~2g/L

甘油                                     0.5~2g/L

十二烷基二甲基甜菜碱              1~3g/L

防腐剂Proclin300                      0.5~1g/L

    制备方法：首先配制浓度为50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)，然后将剩余各组分用50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)逐一溶解，使之成上述浓度即可。

本发明的有益效果如下：

1）本发明可以长期保持酶的活性及HRP（辣根过氧化物酶）偶联物的空间构象，并且稳定性好，可显著改善测试试剂盒的货架寿命，提高其商业价值。降低运输过程对酶联免疫测定法(ELISA)试剂盒的影响，保证试剂盒的实验重复性。

2）本发明为液体即用试剂，使用方便快捷，减少了人为操作误差，提高测试结果的准确度和可靠性，可广泛适用于各种HRP作标记酶的分析实验。本发明所设计的的HRP（辣根过氧化物酶）保护剂可以将HRP偶联物直接保存在非常低的工作浓度下。不仅可以省去实验前预稀释的步骤，还可以保持HRP抗体偶联物及HRP偶联的中性亲和素的活性。

图1为本发明的保护剂与其他保护剂的保护效果对比图。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

配制HRP（辣根过氧化物酶）保护剂，其组分和浓度为 ：

HEPES缓冲液(pH=7.4)             50mM

BSA                                     1g/L

MgSO4                                10mM

NaCl                                    1mM

ZnSO4                                  0.5mM

β-环糊精                              0.3g/L

海藻糖                                 1g/L

甘油                                    1g/L

十二烷基二甲基甜菜碱              2g/L

防腐剂Proclin300                     0.5g/L

制备方法：首先配制浓度为50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)，然后将剩余各组分用50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)逐一溶解，使之成上述浓度即可。

实施例2

本发明提供的HRP（辣根过氧化物酶）保护剂包含的组分及其含量如下：

HEPES缓冲液(pH=7.4)             50mM

BSA                                     1g/L

MgSO4                                 8mM

NaCl                                    0.5mM

ZnSO4                                  0.2mM

β-环糊精                             0.1g/L

海藻糖                                 0.5g/L

甘油                                    0.5g/L

十二烷基二甲基甜菜碱             1g/L

防腐剂Proclin300                   0.5g/L

     制备方法：首先配制浓度为50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)，然后将剩余各组分用50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)逐一溶解，使之成上述浓度即可。

实施例3

本发明提供的HRP（辣根过氧化物酶）保护剂包含的组分及其含量如下：

HEPES缓冲液(pH=7.4)             50mM

BSA                                     2g/L

MgSO4                                10mM

NaCl                                   2mM

ZnSO4                                 1mM

β-环糊精                             0.5g/L

海藻糖                                  2g/L

甘油                                     2g/L

 十二烷基二甲基甜菜碱               3g/L

防腐剂Proclin300                     1g/L

      制备方法：首先配制浓度为50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)，然后将剩余各组分用50mM HEPES缓冲液(pH=7.4)逐一溶解，使之成上述浓度即可。

HRP抗体偶联物保质期可以间接反映HRP（辣根过氧化物酶）保护剂的保护效果。

具体方法如下：

辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体与被分析物结合后，通过ELISA检测过氧化物酶信号判断HRP抗体偶联物保质期（数值以新鲜稀释的HRP抗体偶联物信号的百分比表示）。通过保质期的长短来反映HRP保护剂的效果。

分别用在市场上得到广泛认可的坎德生物科技公司酶稳定剂产品（简称：对比组）和实施例1得到的HRP保护剂来稳定HRP偶联抗体。如图1，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体与被分析物结合后，测定的过氧化物酶信号判断HRP抗体偶联物的保质期。数值以新鲜稀释的HRP抗体偶联物信号的百分比表示。在45℃持续测试30天，通过ELISA检测过氧化物酶的信号，测出HRP偶联抗体与被分析物的结合活性剩余百分比。

    由图1可知，用实施例1所得的HRP酶保护剂稀释的抗体偶联物在45℃下孵育30天后， HRP酶活性仍维持在85%左右。这表明，根据Arrhenius（阿伦尼乌斯）公式，保守估计，酶在4℃保存2年后酶活仍能保持80%以上。而对比组的酶活仅维持在51%。 

综上所述，本发明所涉及的HRP（辣根过氧化物酶）保护剂，能大大提高HRP偶联物的稳定性，延长试剂盒的货架寿命；提高了运输和储存条件下试剂抗质变能力； 降低实验重复的不稳定性，是一种高效稳定的HRP（辣根过氧化物酶）保护剂。