技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性 疾病药物中的应用。

背景技术

1.骨髓间质干细胞功能

骨髓中包含两种完全不同的干细胞：造血干细胞和间质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)，前者维持造血，而后者则构成了骨髓造血的 微环境。这两种独立而且完全不同的干细胞不仅共存而且在功能上互相协作，共 同完成成人体内血液系统的再造。除骨髓外，其他组织也存在少量MSCs，但成 人中骨髓中含量最多，约占其有核细胞0.001～0.01％，因此骨髓是较为适合的 MSCs来源。

1970年Friedenstein通过成纤维细胞集落形成单位试验在体外证明了MSCs 的存在；经过长期的研究，人们对其功能已有了比较深入的了解。骨髓MSCs为 多潜能的成体基质细胞，能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪 细胞；在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝 胰细胞等多种其他组织细胞。MSCs对多种损伤组织具有替代修复作用，植入体 内后可在多种造血以外的组织如肺、骨、软骨和皮肤等处定位和分布。

除了分化作用外，骨髓MSCs还具有较强的免疫调控能力，对T、B、树突 状细胞和NK细胞均有调节性抑制作用。研究表明，MSCs可抑制T细胞增殖， 引起T细胞分化停滞，并可抑制T细胞活化，下调相应肽段对幼稚性(naive) 及记忆性抗原特异T细胞效应，诱导T细胞失能(anergy)；此外MSCs还可诱 导产生调节性T细胞来进行调控。MSCs可抑制B细胞增殖(B细胞/MSCs为 1:1时作用最强，而达1:5或1:10时作用消失)，抑制B细胞分化并影响B细胞 趋化(与MSCs共培养后B细胞表达趋化因子CXCR4、CXCR5和CXCR7受体 减少，从而出现趋化能力缺陷)。对于树突状细胞，MSCs可抑制其增殖及分化 成熟，可阻止单核细胞和骨髓前体细胞分化为树突状细胞，抑制CD1a、CD40、 CD80、CD86及HLA-DR上调，使细胞维持未成熟状态；MSCs还可改变其细 胞因子分泌能力，从而影响树突状细胞功能。MSCs同样能够抑制NK细胞的增 殖，其表面存在多种成分可影响NK细胞活化(包括NKG2D配体如MICA、 ULBPs和DNAM-1配体如PVR、nectin-2)。

2.间质干细胞应用现状

MSCs可在造血干细胞niche中分泌细胞因子起支持作用，并且降低外周血 单个核细胞同种免疫刺激活性，从而促进造血干细胞移植后造血系统重建。2000 年，首项临床试验显示，28例女性乳腺癌患者在接受自体造血干细胞移植时给 予MSCs单次输注，其造血恢复加快且无副反应。2005年另一项多中心研究也 显示46例患者同时行异基因造血干细胞和MSCs治疗后多数造血恢复加快，未 发现副作用。

2004年，Le Blanc报道首个MSCs治疗移植物抗宿主病(GVHD)病例，患儿 为淋巴细胞白血病患者，MSCs由其母亲提供，于造血干细胞移植70天和170 天时分别输注1次，患儿症状改善，胆红素水平下降。2008年，Le Blanc报道 了MSCs治疗重度难治性GVHD II期临床研究结果，共治疗55例患者，结果 30例患者完全缓解，另9例部分缓解。目前III期研究正在进行中。

MSCs可同时修复心肌和血管组织、具有免疫调节活性，并且具有易培养扩 增满足移植需要的特点，这使其在心血管疾病治疗中存在理论价值，目前已应 用于心肌梗塞、心肌缺血、心功能衰竭的治疗。经心肌直接注入是最常用的治 疗方式，初步研究显示可改善心脏射血分数，提高患者生存率，但其疗效和安 全性尚有待对照研究加以证实。

MSCs在神经系统疾病(如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化)、成骨不全、皮 肤创伤也有一些初步应用。由于MSCs的靶向性，在动物研究中已有用于肿瘤 治疗的报道。

3.自身免疫性疾病常规治疗

自身免疫性疾病(autoimlnune disease)是指以自身免疫应答反应导致组织器 官损伤和相应功能障碍为主要发病机制的一类疾病。是临床上常见的一大类疾 病，目前已被公认的自身免疫性疾病至少有30多种。根据自身免疫反应对组织 器官造成损伤的范围，通常将自身免疫病分器官特异与非器官特性两大类。

临床上常见的自身免疫性疾病包括：结缔组织疾病：类风湿关节炎(RA)、 幼年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、多肌炎/皮肌 炎(PM/DM)、硬皮病(SSC)、系统性血管炎；神经肌肉疾病：多发性硬化症(MS)、 重症肌无力(MG)、脱髓鞘疾病；内分泌性疾病：原发性贤上腺皮质萎缩、慢性 甲状腺炎、青少年型糖尿病；消化系统疾病：慢性非特异性溃疡性结肠炎(Crohn 病)、慢性活动性肝炎、恶性贫血与萎缩性胃炎；泌尿系统疾病：自身免疫性肾 小球肾炎、肺肾出血性综合征；血液系统疾病：自身免疫性溶血性贫血、原发 性血小板减少性紫癜(ITP)、特发性白细胞减少症。

自身免疫性疾病的常规治疗方法有：

(1)肾上腺皮质激素：是多数自身免疫性疾病最常用的治疗药物，具有较 快抑制免疫反应和较强的抗炎作用。近年采用的激素冲击疗法提高了危重症的 缓解率，但是激素也有不少副作用，长期应用可以抑制下丘脑-垂体-肾上腺系统， 垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素的量明显减少，使肾上腺皮质素分泌减少，皮 质腺出现萎缩，从而患者需要长期服用激素维持治疗，并且他们的应激能力减 弱，容易出现感冒及各种感染，在受到外伤、冷风刺激、精神刺激、手术治疗 其它疾病等应激状态时，由于体内激素的分泌不足，一方面可能诱发自身免疫 性疾病发生或加重，另一方面会出现疲乏无力，食欲减退，低血糖反应，肌肉 关节疼痛等肾上腺皮质分泌激素不足的症状。此外，激素还可导致肥胖、多毛、 高血压、青光眼、糖尿病、消化道溃疡、出血、精神症状、骨质疏松、股骨头 坏死等。

(2)免疫抑制剂：自身免疫反应对多数自身免疫性疾病的发生发展有密切 关系，除激素外，临床工作中往往还需应用1—数种免疫抑制剂以控制患者病情 发展。常用的免疫抑制剂有环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯等，这 些药物的主要副作用有胃肠道反应、血液系统损害、泌尿系统反应、影响生育、 脱发、增加肿瘤发生率等。大剂量人体免疫球蛋白静脉注射通过抗体封闭作用 治疗激素和免疫抑制剂不能控制的难治性患者，国内外均有成功经验，但此法对 不同的病人疗效差异很大，也有一定的毒副作用，价格昂贵，应用受限。

(3)造血干细胞移植：尽管给予了激素和免疫抑制剂治疗，仍有不少病人 病情得不到控制或不能耐受常规治疗带来的严重不良反应，这促使临床工作者 不断探索新的治疗方法。造血干细胞移植(HSCT)是近十余年来发展起来的一 项治疗手段，在治疗自身免疫性疾病时主要采用了自体HSCT方式，其治疗原 理有两方面，一是在预处理时，通过大剂量化疗或全身照射摧毁患者的异常免 疫系统，对自身免疫性疾病起缓解作用；二是移植的自体外周血干细胞以重建 正常的免疫系统，在免疫重建中阻断自身抗体的产生或诱导对自身抗原的免疫 耐受。根据最新统计，目前全世界有近1000例难治性自身免疫性疾病患者接受 了HSCT，其中包括SSc 190例，SLE 86例，PM/DM 14例，RA 86例，MS 368 例，克罗恩病21例。由于自体免疫疾病自体HSCT后仍有部分患者病情不能控 制，部分病例在术后复发，加之移植治疗风险较高，相关死亡率约为7％，高于 非自身免疫性疾病(3％)，制约了该技术的广泛应用。移植相关死亡率与具体 病种相关，从高到低依次为SSc、SLE、MS和RA；病例选择、支持治疗、预处 理方案、是否去移植物中的淋巴细胞等也影响患者的存活率。

发明内容

本发明的目的是提供骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的 应用。

所述的自身免疫性疾病是指包括系统性红斑狼疮、系统性硬化症、混合性 结缔组织病、类风湿关节炎、多发性肌炎/皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、炎 性肠病、白塞病、原发性胆汁性肝硬化等在内的一大类疾病。

本发明中，所述自身免疫性疾病尤其是指系统性硬化症、克罗恩病、多发 性肌炎/皮肌炎、难治性自身免疫性溶血性贫血、混合性结缔组织病、类风湿关 节炎、白塞病或原发性胆汁性肝硬化。

所述的骨髓间质干细胞以如下方法制备：

(1)取髂后上棘为穿刺点，用肝素稀释液接入穿刺针接口，缓慢抽取骨髓， 并用PBS稀释；

(2)向淋巴细胞分离液(Ficoll)中加入经过步骤(1)所述骨髓的稀释液， 离心后，吸出灰白色的淋巴细胞，然后用PBS洗涤；

(3)在37℃、5％ CO2、饱和湿度CO2培养箱中，将步骤(2)得到的淋巴 细胞，用含10％胎牛血清的L-DMEM完全培养液培养，24h后首次换液，去掉 非贴壁细胞，以后每三天以L-DMEM完全培养液换液。

(4)培养至贴壁细胞90％融合时，进行传代，用PBS洗涤细胞，用胰酶消化， PBS洗涤后，置37℃、5％CO2、饱和湿度CO2培养箱培养中用L-DMEM完全 培养液培养。

(5)取各代骨髓间质干细胞测定细胞表面标记并测定其核型，得具有间质干细 胞特征且染色体核型正常的骨髓间质干细胞。

发明人通过调研大量的案例，发现自身免疫性疾病患者的骨髓MSCs存在异 常，在疾病的发生发展中起重要作用。例如系统性红斑狼疮患者的骨髓MSCs 体外生长较正常人缓慢，易衰老，传代过程(10代)中活力会逐渐丧失，白细胞介 素6、7mRNA表达降低，并且MSCs存在细胞骨架异常。发明人最近的研究又 发现系统性红斑狼疮骨髓MSCs体外向脂肪及软骨细胞的分化能力较正常明显 降低，移植到裸鼠体内成骨也明显下降。另外，还发现系统性红斑狼疮患者的骨 髓MSCs和正常人外周血单个核细胞在体外共培养时，刺激调节性T细胞(Treg) 上调的能力也明显低于正常MSCs。由于自身免疫性疾病患者存在MSCs异常， 因此，自身免疫性疾病不仅是“造血干细胞病”，而且也是“间质干细胞病”。这 也是为什么自体HSCT治疗自身免疫性疾病复发率高的原因，而异体HSCT存 在的高排斥反应、高死亡率和高费用又限制了它的临床应用。因为骨髓MSCs 有独特的免疫调节和修复作用，所以能应用于制备治疗自身免疫性疾病药物中。

本发明提出骨髓MSCs在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。采用 骨髓MSCs制备获得的治疗自身免疫性疾病的药物与自身免疫性疾病常规治疗 药物相比较，具有以下优点：骨髓MSCs作为治疗自身免疫性疾病药物的活性 成分，有独特的免疫调节和修复作用，用于治疗自身免疫性疾病具有“治疗方便、 疗效持久”的特点，能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物带来的各种 副作用，甚至可能停用免疫抑制剂等药物治疗，降低死亡率和致残率，改善患 者生活质量；同时，以骨髓MSCs为活性成分的治疗自身免疫性疾病的药物较 其他新型的生物制剂费用低，多数患者具有相应的经济能力。因此骨髓MSCs 在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用具有巨大的社会和经济效益。

附图说明

图1表示克罗恩病患者骨髓MSCs移植前后肠镜变化，其中图1(1)表示移 植前罗恩病患者肠镜照片，图1(2)表示移植后半月罗恩病患者肠镜照片；

图2表示皮肌炎患者骨髓MSCs治疗前后肌肉核磁共振(MRI)变化，其中图 2(1)表示骨髓MSCs治疗前皮肌炎患者肌肉MRI，图2(2)表示骨髓MSCs 治疗后皮肌炎患者肌肉MRI。