本发明涉及一种脂质体，尤其涉及一种透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体及其制备方法。

肿瘤治疗是当今的未解难题，是医学界一直面临的一个重大挑战。药物治疗是肿瘤治疗的一个重要手段，传统抗肿瘤药物虽取得一定的疗效，但其造成的过敏反应、骨髓造血系统抑制、脱发等毒副作用，极大限制了其在临床应用，成为临床治疗的难题之一。如何提高肿瘤治疗的疗效是当今医学一个亟待解决的问题。针对这一缺点，靶向治疗成为肿瘤治疗的研究热点，以纳米作为靶向载体成为医药学者研究的焦点。

所谓靶向药物治疗就是使药物瞄准肿瘤部位，在局部保存相对高的浓度，延长药物的时间，提高对肿瘤的杀伤力，而对正常组织细胞作用较小。目前，用于肿瘤靶向治疗的药物有化疗药（如缓释化疗药，脂质体化疗药），化学消融药（如无水乙醇，冰醋酸，盐酸，硫酸等蛋白凝固剂），基因及分子靶向药，中药等。药物可通过多条途经给予，如经皮穿刺给药、术中给药、内镜或腔镜下肿瘤局部给药、血管介入给药、药物经皮超声电导疗法、腔内药物灌注等。同时，还衍生出冷冻化学疗法、热化学疗法、放化疗同步疗法等新的治疗方法，大大减轻了患者痛苦，明显提高了疗效。

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种常用的广谱抗肿瘤药，由红豆杉属植物提取，具有独特抗癌机制，属于新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂，对卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种晚期癌症有一定疗效。但由于其在水中的溶解度极小，口服无法吸收，现临床应用的PTX注射液以聚氧乙烯蓖麻油及无水乙醇作为助溶载体，但使用时引起多种毒副作用, 其中过敏反应最为严重，加上其缺乏靶向性，用量较大，更加增加其毒副作用，使其应用严重受限。

针对PTX水溶性差、缺乏靶向性，现有技术中，将PTX制成脂质体。脂质体为一种新型纳米药物载体，在药物运送方面具有高效、稳定等优点，是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡结构，疏水性药物通过疏水作用嵌在脂质体疏水双分子层中，以脂质体为载体，不仅可减少机体的超敏反应，还可提高疏水性药物在水中的溶解量，降低药物的应用剂量。近些年纳米颗粒连接靶向分子，进行肿瘤靶向治疗，有了很大的进展。

如中国发明专利申请号200610137900.6（公开号为101176719A），该发明提供了一种紫杉醇多烯紫杉醇脂质体组合药物及其制备方法，所提供药物减少药物剂量近一倍，而疗效可以提高15%以上，药物的毒副作用大大减少。

又如中国发明专利申请号200710010448.1，该发明提供了一种紫杉醇脂质体及其制备方法，解决了紫杉醇水不溶性缺点，紫杉醇热敏长循环脂质体不仅具有紫杉醇普通脂质体制剂的低毒性、高稳定性和减少毒副作用等特点，还同时具有长循环脂质体的长循环性以及热敏脂质体的热敏性，可延长紫杉醇在体内的循环时间，提高对肿瘤的靶向性，从而提高其抗肿瘤作用。

但是，目前国内外有关透明质酸寡聚糖（hyaluronan oligosaccharides，oHA）制备PTX纳米材料的方法，尚未见报道。oHA作为靶点分子靶向肿瘤细胞表面CD44有效杀伤肿瘤细胞的同时，不对正常细胞造成影响。与普通脂质体相比，具有稳定性强、包封率高的特点，是一种理想的抗肿瘤药物，因此，如果开发出oHA-PTX-Lipid靶向治疗肿瘤的潜力，将对肿瘤治疗产生巨大的影响。

针对现有技术中PTX水溶性差、缺乏靶向性的弱点，本发明的目的在于提供一种透明质酸寡聚糖包裹紫杉醇脂质体（oHA-PTX-Lipid）及其制备方法。oHA-PTX-Lipid可以有效提高PTX在水中的溶解量，通过oHA靶向肿瘤细胞表面CD44受体，有效提高其在肿瘤部位的浓度，减少PTX的用药剂量，增强其生物利用度。

根据本发明的另一个方面，提供一种透明质酸寡聚糖包裹紫杉醇脂质体的制备方法，即首先通过薄膜水化法，用磷脂制得载药脂质体，然后，将其与oHA孵育过夜，双蒸水充分透析，经高压均质机均质，即得透明质酸寡聚糖包裹紫杉醇脂质体oHA-PTX-Lipid，该法步骤简单，操作简便，获得的oHA-PTX-Lipid大小均一，包封率高，性质稳定。

具体地，本发明提供了一种透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，称取磷脂和紫杉醇，制备磷脂-紫杉醇蜂窝状薄膜，其中，磷脂与紫杉醇的质量比为（20~50）:1；

步骤2，将制得的薄膜水化，使磷脂的质量百分浓度为1%~5%；

步骤3，将透明质酸寡聚糖与乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺在pH值为3~6的醋酸盐缓冲液中35~50℃预孵育，得到透明质酸寡聚糖-醋酸盐缓冲液；

步骤4，将步骤2获得的悬浊液加入到步骤3获得的透明质酸寡聚糖-醋酸盐缓冲液中，35~50℃孵育；

步骤5，将步骤4获得的混合物分离，制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体；

其中，磷脂、紫杉醇、透明质酸寡聚糖和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的质量比为（20~50）: 1:（0.25~1）:（2.5~10），透明质酸寡聚糖与醋酸盐缓冲液的质量体积比为（2~8）g: 1mL。

其中，制备所述蜂窝状薄膜可以采用的方法如：将磷脂和紫杉醇溶解在溶剂中，并优选为溶解在易挥发溶剂中，然后溶剂挥发制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体。

所述易挥发溶剂可以选自三氯甲烷、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、叔丁基醚、正庚烷、乙醚、甲醇、甲苯、苯等中的至少一种。

优选地，所述易挥发性溶剂为三氯甲烷和甲醇的混合物，两者体积比为65: 35。 

优选地，步骤1中，所述磷脂选自二烷酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC）、二烷酰基磷脂酰醇胺、二油酰基磷脂酰醇胺、二烷酰基磷脂酰甘油和二烷酰基磷脂酰氨基酸等中的至少一种。

优选地，所述二烷酰基磷脂酰胆碱为二C10~ C20烷酰基磷脂酰胆碱，如二C12烷酰基磷脂酰胆碱（DLPC）、二C14烷酰基磷脂酰胆碱（DMPC）、二C16烷酰基磷脂酰胆碱（DPPC）、二C18烷酰基磷脂酰胆碱（DSPC）等。

优选地，所述二烷酰基磷脂酰醇胺为二烷酰基磷脂酰乙醇胺。

优选地，所述二烷酰基磷脂酰乙醇胺为二C10~ C20烷酰基磷脂酰乙醇胺，如二C12烷酰基磷脂酰乙醇胺（又名为二月桂酰磷脂酰乙醇胺，DLPE）、二C14烷酰基磷脂酰乙醇胺（DMPE）、二C18烷酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE）等。

优选地，所述二油酰基磷脂酰醇胺为二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）。

优选地，所述二烷酰基磷脂酰甘油为二C10~ C20烷酰基磷脂酰甘油，如二- C12烷酰基磷脂酰甘油（又名为二月桂酰磷脂酰甘油，DLPG）等。

优选地，所述二烷酰基磷脂酰氨基酸为二烷酰基磷脂酰丝氨酸。

优选地，所述二烷酰基磷脂酰丝氨酸为二C10~C20烷酰基磷脂酰丝氨酸，如二C18烷酰基磷脂酰丝氨酸（DSPS）等。

优选地，所述磷脂为DLPE和DLPG的混合物，其中，DLPE和DLPG的质量比为（9~1）: 1。

优选地，步骤2中，水化至少2h。

优选地，步骤2中，薄膜在45℃旋转水化至少2h。

优选地，步骤3中，所述醋酸盐缓冲液的pH为4.5。

优选地，步骤3中预孵育至少1~3h，步骤4中孵育为至少4~12h。

优选地，步骤3中预孵育至少2h，步骤4中孵育为至少8h。

优选地，步骤3中预孵育温度为37℃，步骤4中孵育温度为37℃。

优选地，步骤5中，将步骤4获得的混合物透析，均质，干燥，制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体。

优选地，所述透析具体为：将步骤4所得混合物转移至截留分子量为10000的透析袋中，双蒸水充分透析24h。

优选地，所述均质具体为：采用高压均质机均质，压力1.5-2万PSI，循环次数5-10次。

本发明还提供了一种上述制备方法制备的透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体。

优选地，所述透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体中紫杉醇的含量为2~5wt%，透明质酸寡聚糖含量为0.8~1.2wt%。

优选地，所述透明质酸寡聚糖含量为1wt%。

本发明提供的透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体大小均一，包封率高，性质稳定，能长期保存克服了PTX水溶性差、缺乏靶向性等缺点，可用于乳腺癌，卵巢癌，头颈癌等CD44高表达的恶性肿瘤的靶向治疗，有效提高PTX的生物利用度。实验研究结果表明，本发明制备的oHA-PTX-Lipid在体外、体内都表现出良好的抗肿瘤效果，与传统的PTX相比，明显提高其抗肿瘤效果。

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述，以更好地理解本发明。

实施例1

称取820mg DLPE、380mg DLPG和40mg PTX，加20ml有机溶剂溶于250ml圆底烧瓶，50℃混匀10-20min，真空抽干4h，-80℃冰箱2h，冷冻干燥过夜后，用26ml双蒸水水化，45℃，150r/min，至少2h；同时将10mg 透明质酸寡聚糖（oHA ）与200mg乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC） 溶于5ml醋酸盐缓冲液中，37℃，150 r/min，预孵育2h；将水化完成后悬浊液加入到预孵育后缓冲液中，37℃，150 r/min，孵育过夜；然后双蒸水透析24h；高压均质，压力1.5万左右，循环10次；超净台0.22μm滤器过滤；分装，-80℃冻过夜，抽干成粉末，制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体（oHA-PTX-Lipid）。

测量本实施例制得的oHA-PTX-Lipid的平均粒径在120nm左右，大小均一，性质稳定。高效液相法测量计算PTX的含量为3wt%，咔唑法测量计算oHA的含量为1wt%。将其作用于乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231上，检测其对乳腺肿瘤细胞的杀伤作用，结果显示：与相同浓度的单纯PTX-市售药泰素相比其杀伤作用增强2倍，说明本实施例制备的oHA-PTX-Lipid达到了靶向杀伤肿瘤细胞的作用，降低了PTX的使用剂量，有效提高了PTX的生物利用度。

实施例2

称取1440.3mgDLPE、175.0mgDLPG和50.0mgPTX ，加15ml有机溶剂溶于250ml圆底烧瓶，50℃混匀10-20min，真空抽干2h，-80℃冰箱2h，冷冻干燥过夜后，用35ml双蒸水水化，45℃，150 r/min，至少2h；同时将14mg oHA 与240mg EDAC 溶于7ml醋酸盐缓冲液中，37℃，150 r/min，预孵育2h；将水化完成后悬浊液加入到预孵育后缓冲液中，37℃，150 r/min，孵育过夜；双蒸水透析24h；高压均质，压力1.5万左右，循环10次，超净台0.22μm滤器过滤，分装，-80℃冻过夜，抽干成粉末，制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体（oHA-PTX-Lipid）。

测量本实施例制得的oHA-PTX-Lipid的平均粒径在120nm左右，大小均一，性质稳定。高效液相法测量计算PTX的含量为5wt%，咔唑法测量计算oHA的含量为1wt%。将其作用于乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231上，检测其对乳腺肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示：与相同浓度的单纯PTX-市售药泰素相比其杀伤作用增强2倍，说明本实施例制备的oHA-PTX-Lipid达到了靶向杀伤肿瘤细胞的作用，降低了PTX的使用剂量，有效提高了PTX的生物利用度。

实施例3

称取600.0mg DLPE、600.0mg DLPG和40.0mg  PTX，加15ml有机溶剂溶于250ml圆底烧瓶，50℃混匀10-20min，真空抽干2h，-80℃冰箱2h，冷冻干燥过夜后，用35ml双蒸水水化，45℃，150 r/min，至少2h；同时将14mg oHA 与240mg EDAC 溶于7ml醋酸盐缓冲液中，37℃，150 r/min，预孵育2h；将水化完成后悬浊液加入到预孵育后缓冲液中，37℃，150 r/min，孵育过夜；双蒸水透析24h，高压均质，压力1.5万左右，循环10次，超净台0.22μm滤器过滤，分装，-80℃冻过夜，抽干成粉末，制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体。

测量本实施例制得的oHA-PTX-Lipid的平均粒径在120nm左右，大小均一，性质稳定。高效液相法测量计算PTX的含量为2wt%，咔唑法测量计算oHA的含量为1wt%。将其作用于乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231上，检测其对乳腺肿瘤细胞的杀伤作用。结果显示：与相同浓度的单纯PTX-市售药泰素相比其杀伤作用增强2倍，说明本实施例制备的oHA-PTX-Lipid达到了靶向杀伤肿瘤细胞的作用，降低了PTX的使用剂量，有效提高了PTX的生物利用度。

实施例4

称取800.0mg DLPE、600.0mg DLPG和40.0mg  PTX，加15ml有机溶剂溶于250ml圆底烧瓶，50℃混匀10-20min，真空抽干2h，-80℃冰箱2h，冷冻干燥过夜后，用35ml双蒸水水化，45℃，150 r/min，至少2h；同时将16mg oHA 与280mg EDAC 溶于8ml醋酸盐缓冲液中，37℃，150 r/min，预孵育2h；将水化完成后悬浊液加入到预孵育后缓冲液中，37℃，150 r/min，孵育过夜；双蒸水透析24h，高压均质，压力1.5万左右，循环10次，超净台0.22μm滤器过滤，分装，-80℃冻过夜，抽干成粉末，制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体。

实施例5

称取900.0mg DLPE、600.0mg DLPG和40.0mg  PTX，加15ml有机溶剂溶于250ml圆底烧瓶，50℃混匀10-20min，真空抽干2h，-80℃冰箱2h，冷冻干燥过夜后，用35ml双蒸水水化，45℃，150 r/min，至少2h；同时将20mg oHA 与300mg EDAC 溶于10ml醋酸盐缓冲液中，37℃，150 r/min，预孵育2h；将水化完成后悬浊液加入到预孵育后缓冲液中，37℃，150 r/min，孵育过夜；双蒸水透析24h，高压均质，压力1.5万左右，循环10次，超净台0.22μm滤器过滤，分装，-80℃冻过夜，抽干成粉末，制得透明质酸寡聚糖包裹的紫杉醇脂质体。

测量实施例4~5制得的oHA-PTX-Lipid的大小均一，性质稳定，且实验结果表明实施例4~5作用于乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231也能达到了靶向杀伤肿瘤细胞的作用，降低了PTX的使用剂量，有效提高了PTX的生物利用度。

脂质体为一种新型纳米药物载体, 在药物运送方面具有高效、稳定等优点，是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡结构，疏水性药物通过疏水作用嵌在脂质体疏水双分子层中，以脂质体为载体，不仅可减少机体的超敏反应，还可提高疏水性药物在水中的溶解量，降低药物的应用剂量。本发明oHA-PTX-Lipid中脂质体可以增强PTX在水中的分散度，脂质体上连接oHA可以靶向结合细胞表面CD44受体。CD44受体是一种广泛分布于细胞表面的跨膜糖蛋白受体，属于黏附因子家族，介导细胞与细胞外基质粘附，淋巴细胞归巢等多种生理和病理过程。研究发现，CD44受体在许多肿瘤细胞上高度表达，其主要配体为透明质酸（HA）。oHA是HA的降解产物，与HA具有相似的糖醛酸结构，只是oHA的双糖单位数目较少，oHA同样具有特异性与CD44结合的能力。但是与HA相比，oHA具有代谢清除率低、解除肿瘤细胞表面糖外衣等生物学功能优势，同时oHA溶解度高于HA，技术制作上优于HA作为靶向分子接连。基于肿瘤细胞表面CD44可与oHA结合，使得oHA可成为治疗CD44高表达肿瘤细胞的靶向性配体。运用oHA携带化疗药物，可以降低CD44高表达肿瘤动物模型中肿瘤大小，提高肿瘤部位药物浓度，达到靶向治疗肿瘤的效果。近些年纳米颗粒连接靶向分子，进行肿瘤靶向治疗，有了很大的进展。本发明脂质体表面的oHA可直接靶向肿瘤细胞表面CD44受体，解除肿瘤细胞表面HA糖外衣，提高肿瘤部位PTX浓度，增强其杀伤活性及生物利用度，为肿瘤靶向治疗开辟了一条新的途径。目前国内外有关oHA制备PTX纳米材料的方法，尚未见报道。

而且本发明oHA-PTX-Lipid中oHA作为靶点分子靶向肿瘤细胞表面CD44有效杀伤肿瘤细胞的同时，不对正常细胞造成影响。与普通脂质体相比，具有稳定性强、包封率高的特点，是一种理想的抗肿瘤药物。本发明oHA-PTX-Lipid作为靶向性抗肿瘤药物具有进入临床应用的潜力，在肿瘤治疗方面可产生很大突破。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。