本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种用于雄激素受体转录 后修饰位点预测的体外迷你报告基因及应用。

癌症占人类死亡病因的近1/4。在过去的几十年里肿瘤复发和转移仍是改善 整体存活率的主要障碍，这可能主要归因于人们对于癌症生物学仍然缺乏全面 的了解。例如，功能基因组学研究的最新进展表明，参与人类基因转录的绝大 多数是非编码RNA包括长链非编码RNA(lncRNAs)。然而，对于lncRNAs在调 控癌症基因表达及机制等方面人类仍然所知甚少[1]。

近期我们通过对肿瘤表观遗传机制的研究发现lncRNAs可以通过多种机 制调控肿瘤的进展。新近有研究表明lncRNAPCGEM1可以与雄激素受体(AR) 结合作用[2]。PCGEM1在前列腺癌上调[3]，可促进细胞增殖[4]，而我们则通过 临床标本研究发现，PCGEM1以及PCAT1的基因表达与前列腺癌恶性程度及转 移复发呈高度相关性，PCGEM1不但可以通过与AR直接作用，更重要的是 PCGEM1与AR异构体,如AR-V7(AR3)的表达呈高度正相关，我们进一步证 明了PCGEM1通过选择性转录修饰调控了AR的异构体如AR3的表达。由此发 现lncRNAs如PCGEM1可能通过调控AR基因转录的表观遗传机制参与AR相 关肿瘤的增殖、恶性侵袭复发及转移驱动。因为在一定程度上是由于AR的异 构体如AR3介导了该类肿瘤的激素去势抵抗，而并非野生型全长AR。而研究 已表明AR3在AR在很大程度上诱导形成了相关肿瘤如前列腺癌的激素去势抵 抗[5]。

针对上述AR相关肿瘤的特异性调节lncRNAPCGEM1显著参与调控了与该 类肿瘤的激素去势抵抗相关AR异构体(如AR3)的表达。本发明是建立在研 究所表明的lncRNAPCGEM1或hnRNPA1和U2AF65参与调控的表观遗传机 制的基础上，即lncRNAsPCGEM1通过调控雄激素受体异构体AR3pre-mRNA 的转录后修饰及共定位，直接决定了表达雄激素受体的肿瘤如前列腺癌、肺癌 及乳腺癌等的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移。

本发明涉及的迷你报告基因质粒主要是建立在表观遗传机制调控的基础 上，如lncRNAPCGEM1通过调控雄激素受体异构体AR3pre-mRNA的转录后 修饰，直接决定了表达雄激素受体的肿瘤如前列腺癌、肺癌及乳腺癌等的激素 去势治疗后去势抵抗或复发转移。应用该迷你报告基因，可以验证lncRNA  PCGEM1或hnRNPA1,U2AF65等转录修饰剪切因子的作用机制。上述调节因 子可以通过该迷你报告基因上表现出经基因转录后修饰机制对雄激素受体(AR) 异构体产生的调控作用。一方面，该迷你报告基因用于预测前列腺癌等雄激素 受体相关肿瘤的激素去势复发及转移的高度危险因子；另一方面，通过该迷你 报告基因，可以能够直观和高效、准确的验证和阻断该特异性目标基因位点的 表达及作用。最终服务于临床雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后复发及转 移的靶向治疗。为临床有效靶向阻断PCGEM1所介导的雄激素受体异构体AR3， 可以有效的降低雄激素受体(AR)相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复 发转移情况。本发明的AR3迷你报告基因及试剂盒是基于当前最新的研究结果 而建立。这是一种目前其他方法都无法替代的技术方法，迄今为止尚未见相关 报道。

参考文献：1.Xie C,Yuan J,Li H,Li M,Zhao G,Bu D,et al.NONCODEv4: exploring the world of long non-coding RNA genes.Nucleic acids research.2013； doi:10.1093/nar/gkt1222.

2.Yang L,Lin C,Jin C,Yang JC,Tanasa B,Li W,et al.lncRNA-dependent  mechanisms of androgen-receptor-regulated gene activation programs.Nature. 2013；29:598-602.

3.Srikantan V,Zou Z,Petrovics G,Xu L,Augustus M,Davis L,et al.PCGEM1, a prostate-specific gene,is overexpressed in prostate cancer.Proceedings of the  NationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica.2000；97:12216-21.

4.Petrovics G,Zhang W,Makarem M,Street JP,Connelly R,Sun L,et al. Elevated expression of PCGEM1,a prostate-specific gene with cell  growth-promoting function,is associated with high-risk prostate cancer patients. Oncogene.2004；23:605-11.

5.Antonarakis ES,et al.AR-V7and resistance to enzalutamide and abiraterone  in prostate cancer.The New Englandjournal ofmedicine.2014；371,1028-1038.

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于雄激素受体转录后 修饰位点预测的AR3迷你报告基因。

本发明的再一的目的是，提供所述迷你报告基因的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种用于检测和定量细胞中的AR3表达的试 剂盒。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于雄激素受体转录后修饰位点预测的AR3迷你报告基因，包含序列 如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。

所述AR3迷你报告基因通过下述方法克隆构建组成：

a)通过PCR法，以SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.3所示的序列作为引物， 以人类基因组DNA为模板扩增AR的外显子exon3和部分内含子序列(长 2.3kb)；

b)通过PCR法，以SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.5所示的序列作为引物， 以人类基因组DNA为模板扩增AR的内含子加上部分外显子exon3b序列 (E3b，序列长1kb)；

c)以SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.6所示的序列作为引物，应用PCR法扩 增mCherry；

d)将a)、b)和c)扩增产物通过常规方法顺序连接克隆进pCDH-Pu载体 (SBI)，插入位点为EcoR I和Not I酶切位点。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的AR3迷你报告基因在制备药物中的应用。

所述的AR3迷你报告基因在制备治疗癌症药物中的应用。

所述的癌症是实体瘤，或所述的癌症细胞来源于实体瘤。

所述的癌症为前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌或结肠癌。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于检测和定量细胞中的AR3表达的试剂盒，包含：

a)上述的AR3迷你报告基因；

b)适合重配a)的盐水或缓冲溶液。

本发明目的是提供一种用于雄激素受体(AR)转录后修饰位点预测的体外 迷你报告基因及其应用。

所述迷你报告基因用于诊断AR相关肿瘤的激素去势复发、转移及其他相关 肿瘤，用于协助靶向治疗AR相关肿瘤疾病。

所述迷你报告基因克隆构建引物如下所示：

pCDH-Myc-R1-AR3-E3-5.1(SEQ ID NO.1)：

CCATGGAGGCCCGAATTCTGGGGAAACAGAAGTACCTGTGC

AR-I3-5.2+I3-3.1-R(SEQ ID NO.2)：

CTGGGTGGCTGCGTGTTTTTTAAACTAGATCTGCCTGACT

AR-I3-5.2+I3-3.1-F(SEQ ID NO.3)：

AGTCAGGCAGATCTAGTTTAAAAAACACGCAGCCACCCAG

AR3-mC-5.1(SEQ ID NO.4)：

TGACTTGCCTCATTCAAAAGTGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

AR3-mC-3.1(SEQ ID NO.5)：

CTCCTCGCCCTTGCTCACCACTTTTGAATGAGGCAAGTCA

mC-pCDH-Sal1-3.1(SEQ ID NO.6)：

TCCAGAGGTTGATTGTCGACTTACAGCTCGTCCATGCCGC

所克隆AR3迷你报告基因为一段长约3.3kb的AR的pre-mRNA序列(包 括内含子)，所克隆的AR3迷你报告基因经基因转录剪切修饰后的序列如SEQ  ID NO.13所示。

通过本发明的迷你报告基因，验证PCGEM1所介导的雄激素受体异构体 AR3，可以有效的降低雄激素受体(AR)相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵 抗和复发转移情况。上述方法具有高效及灵敏和特异性强的优点，具有切实的 潜在临床使用价值。

本发明方法优选地用于体外预测和验证治疗或预防癌症靶点，尤其是用于 治疗可能发生在下述组织中的癌症，如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰 腺癌、肝癌、甲状腺癌、肾癌、脑癌、睾丸癌、胃癌、肠癌、脊髓癌、窦癌、 膀胱癌、泌尿道癌或卵巢癌。

本发明也提供了治疗癌症的方法的验证和评价，换而言之，本发明另外涉 及治疗癌症方法的探索。

本发明可以用作研究试剂，用于诊断、预防和治疗。在研究中，该迷你报 告基因可用于对靶基因的功能性分析，或评价其作为治疗干预目标的有效性。 在诊断中，该迷你报告基因可用于检测和定量细胞中的AR-V7(AR3)表达， 通过RNA印迹、原味杂交货类似的技术来实现。

不限于本发明所述的迷你报告基因，使用该报告基因定义的缀合物或该报 告基因组成的药物组合物都在本发明的保护范围内。

本发明优点在于：通过实验表明，lncRNAPCGEM1通过调控雄激素受体异 构体AR-V7(AR3)pre-mRNA的转录后修饰，直接决定了表达雄激素受体的肿瘤 如前列腺癌、肺癌及乳腺癌等的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移，在此基 础上，选取雄激素受体(AR)的pre-mRNA的外显子Exon3和Exon4之间序列 (包含基因转录后剪切修饰前的内含子序列)，通过基因克隆构建迷你报告基 因；一方面，该迷你报告基因用于预测前列腺癌等雄激素受体相关肿瘤的激素 去势复发及转移的高度危险因子；另一方面，通过该迷你报告基因，可以能够 直观和高效、准确的验证和阻断该特异性目标基因位点的表达及作用。

注：本发明中“AR”表示雄激素受体，“AR3”为“AR”的同构体；“lncRNA” 表示长链非编码RNA。

附图1是克隆构建迷你报告基因。

附图2是实施例2定量PCR检测结果。瘤组织中PCGEM1和AR-V7(AR3) 的高表达，且二者具有显著相关性。

附图3是PCGEM1参与调控AR3表达。

附图4是检验PCGEM1通过调节转录修饰因子hnRNPA1调控AR3的表达。 迷你报告基因中的hnRNPA1、U2AF65的基因位点，及hnRNPA1、U2AF65参 与了AR的基因转录后剪切修饰。

附图5是验证AR3迷你报告基因。通过该迷你报告基因，显示PCGEM1 参与的AR的基因转录后剪切修饰，表明了迷你报告基因中的转录修饰因子 hnRNPA1等基因位点，及hnRNPA1参与AR的基因转录后剪切修饰。